Column based DNA purification and Genotyping

<Sangon> Column-based DNA purification

Step1: 配置消化MIX：(180μl ACL Solution + 20μl proteinase K) for each tube

• 保证液体最终能浸没样本（比如鼠尾）
• 加完液体后，对tube贴上封口膜，防止在后续水浴过程中热胀冷缩导致tube开口

Step2：56℃水浴至少3-4h，直到组织被完全消化（轻轻晃一下没有大块的组织，可以晃散）

• 时间可以更长，在水浴的过程中过一段时间就去震荡一下tube，同时倾斜观察样本是否能够被震散
• 震散的情况：倾斜tube，没有明显的大块固体残留，剩余细小的颗粒状固体
• 如果没有震散，则继续水浴

Step3：加入200μl Buffer CL，颠倒混匀

• 这一步可能会出现白色沉淀

Step4：70℃水浴10min至白色沉淀消失

• 此时溶液应变清亮，如果没有，代表细胞裂解不彻底，会导致提取出的DNA不纯或者量少

Step5：加入200μl 无水乙醇，颠倒混匀

Step6：拿出吸附柱，将样本取500μl导入柱子当中

• 这一步保证对于不同的tube取等量的样本液体
• 尽量不要吸到别的杂质，比如毛发等

Step7：静置2min，之后在10,000rpm (~11,200 x g)、RT下离心1min

Step8：倒掉收集管当中的液体，加入500μl的CW1 Solution

• 确认CW1是否已加入无水乙醇

Step9：在10,000rpm (~11,200 x g)，RT下离心30s。如果有必要的话，多次重复离心。

• 在这一步尽量使所有的液体都被离心下去，可多次重复30s的离心过程

Step10：倒掉收集管当中的液体，加入500μl的CW2 Solution

• 确认CW2是否已加入无水乙醇

Step11：在10,000rpm (~11,200 x g)，RT下离心30s

Step12：倒掉收集管当中的液体。在12,000rpm (~13,400 x g)，RT下离心2min

Step13：倒掉收集管当中的液体。敞口放置10min左右晾干

Step14：将一个新的1.5ml的离心管写好标记，等待晾干完成后将上面的分离柱组合进这个新的1.5ml的离心管上。

Step15：每一个tube取50μl的CE Buffer，悬空滴加在吸附柱的中间。静置3min。

Step16：在12,000rpm (~13,400 x g)，RT下离心2min

Step17：重复Step 15-16

Step18：将样本放在-20℃保存

<TIANGEN> Column-based DNA purification

Use TIANamp Genomic DNA Kit

Step1：对于动物组织，先打碎处理为细胞悬液，之后在10,000rpm (~11,200 x g)、RT下离心1min。倒尽上清液，加入200 μl Buffer GA，震荡至彻底悬浮。

Step2：加入20 μl Proteinse K溶液，混匀

• 对于组织基因组的提取，需要在加入酶之后，在56℃下放置（水浴），直到组织溶解
• 可以再进行下一步前进行简短离心去除管盖内壁的水珠
• 通常消化1-3h，直到组织被完全消化（轻轻晃一下没有大块的组织，可以晃散），鼠尾可以消化过夜

Step3：加入200μl Buffer GB，颠倒混匀

• 可能会出现白色沉淀

Step4：在70℃下放置10min

• 此时溶液应变清亮，如果没有，代表细胞裂解不彻底，会导致提取出的DNA不纯或者量少

Step5：加入200 μl无水乙醇，充分震荡混匀15 sec

• 此时可能会出现絮状沉淀
• 可以简短离心去除管盖内壁的水珠

Step6：将吸附柱放进收集管当中，再将Step5所得到的溶液以及絮状沉淀加入到一个吸附柱CB3里，在12,000rpm (~13,400 x g)，RT下离心30 sec

Step7：倒掉废液，将吸附柱CB3放进收集管当中。

Step8：向吸附柱CB3当中加入500μl Buffer GD，在12,000rpm (~13,400 x g)，RT下离心30 sec

• 确认GD是否已加入无水乙醇

Step9：倒掉废液，将吸附柱CB3放进收集管当中

Step10：向吸附柱CB3当中加入600μl Buffer PW，在12,000rpm (~13,400 x g)，RT下离心30 sec

Step11：倒掉废液，将吸附柱CB3放进收集管当中

Step12：重复Step10-11

Step13：将吸附柱放进收集管当中，在12,000rpm (~13,400 x g)，RT下离心2 min

Step14：倒掉废液，将吸附柱CB3放进收集管当中。将吸附柱在室温下放置数分钟，彻底晾干其中的漂洗液

• 放置10 min左右
• 这一步用来去除残留的乙醇，乙醇会干扰后续的酶反应实验

Step15：将吸附柱转移进一个新的收集管当中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl Buffer TE，室温放置2-5min

• 洗脱缓冲液体积不少于50 μl，体积过小会影响回收效率
• 洗脱液的pH会对洗脱效率有很大影响，若用ddH2O做洗脱溶液，应该保证其pH在7.0~8.5之间，pH低于7.0会影响洗脱效率

Step16：在12,000rpm (~13,400 x g)，RT下离心2 min

• 为了增加基因组DNA的得率，可以将离心后的溶液再加入到吸附柱CB3当中，室温放置2min，在12,000rpm (~13,400 x g)，RT下离心2 min

Step17：将收集管当中的溶液转移到一个新的离心管当中

• DNA样本应该保存在-20℃，防止其降解

<TIANGEN>TIANamp Stool DNA Kit

Step0：打一盒冰

Step1：称取粪便180-220 mg（1-2粒）至2 ml离心管当中，并将管子放置在冰上

Step2：向管中加入500 μl Buffer SA，100 μl Buffer SC，15 μl Proteinase K，0.25g的研磨珠。间歇震荡直至完全混匀

Step3：先震荡至完全匀浆状态。之后在70℃水浴15 min，每隔5min震荡一次

• 对于存在革兰氏阳性菌的情况，可以将温度提高至95℃促进裂解

Step4：Vortex混匀15 sec，在12,000rpm (~13,400 x g)，RT下离心3 min

Step5：转移上清液至新的1.5ml离心管中。向管中加入10 μl RNase A

Step6：震荡混匀，室温放置5 min

Step7：加入200 μl Buffer SH，震荡混匀，放置在冰上5 min

Step8：在12,000rpm (~13,400 x g)，RT下离心3 min

Step9：转移上清液至一个新的离心管当中，加入等体积Buffer GFA

• 使用前检查是否已加入异丙醇

Step10：混合完成后，将液体加入到吸附柱CR2当中并组合收集管，在12,000rpm (~13,400 x g)，RT下离心30 sec

Step11：倒掉废液，将吸附柱CR2放进收集管当中

Step12：加入500 μl Buffer GD，在12,000rpm (~13,400 x g)，RT下离心30 sec

• 使用GD前检查是否已加入无水乙醇

Step13：倒掉废液，将吸附柱CR2放进收集管当中

Step14：加入700 μl Buffer PW，在12,000rpm (~13,400 x g)，RT下离心30 sec

• 使用PW前检查是否已加入无水乙醇

Step15：倒掉废液，将吸附柱CR2放进收集管当中

Step16：重复Step 14-15

Step17：在12,000rpm (~13,400 x g)，RT下离心2 min

Step18：倒掉废液，将吸附柱CR2放进收集管当中。将吸附柱在室温下放置数分钟，彻底晾干其中的漂洗液

• 放置10 min左右
• 这一步用来去除残留的乙醇，乙醇会干扰后续的酶反应实验

Step19：将吸附柱转移进一个新的收集管当中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl Buffer TB，室温放置2-5min

• 洗脱缓冲液体积不少于50 μl，体积过小会影响回收效率
• 洗脱液的pH会对洗脱效率有很大影响，若用ddH2O做洗脱溶液，应该保证其pH在7.0~8.5之间，pH低于7.0会影响洗脱效率

Step20：在12,000rpm (~13,400 x g)，RT下离心2 min

• 为了增加基因组DNA的得率，可以将离心后的溶液再加入到吸附柱CB3当中，室温放置2min，在12,000rpm (~13,400 x g)，RT下离心2 min

Step21：将收集管当中的溶液转移到一个新的离心管当中

• DNA样本应该保存在-20℃，防止其降解

PCR

注意引物浓度！！

16p11.2df mice

For 16p11.2df mice (https://www.jax.org/strain/013128)

保持在冰上操作，并保持洁净环境（可以在超净台当中操作）。

Step1：配置PCR反应体系（20μl）

Taq Mix	DNA Sample	Primer LN01 (10μM)	Primer LN02 (10μM)	dd$\text{H}_{2}\text{O}$	Total
10 μl	2 μl	1 μl	1 μl	6 μl	20 μl

Step2：设置PCR流程

1. 94℃. 2:00
2. 94℃, 0:20
3. 52℃, 1:00
4. 72℃, 1:00
5. Goto 2, 30x
6. 72℃. 2:00
7. 10℃, Infinite hold

For SFB Stool

每个样本提取出来的DNA跑两个分别的PCR反应：

1. SFB1008R + SFB779F
2. SFB1380R + SFB779F

注意引物浓度！！

PCR反应体系（25μl，引物浓度100μM）:

Taq Mix	Primer F	Primer R	Sterile $\text{H}_{2}\text{O}$	DNA Sample	Total
12.5 μl	0.1 μl	0.1 μl	11.3 μl	1 μl	25.0 μl

• 在配置的过程中即将Primer: 100μM → 10μM

对于不同的引物浓度（10μM）：

Taq Mix	Primer F	Primer R	Sterile $\text{H}_{2}\text{O}$	DNA Sample	Total
12.5 μl	1 μl	1 μl	9.5 μl	1 μl	25.0 μl

• 根据测得的DNA浓度的不同，适当调整DNA Sample和Sterile $\text{H}_{2}\text{O}$之间的比例

若Taq Mix中不含Loading的上样体系：3μl Loading + 7μl PCR Product

PCR Program：

• Lid：105℃
• Volumn：25μl

1. 95℃, 3:00
2. 94℃, 0:30
3. 58℃, 0:30
4. 72℃, 0:45
5. Goto 2, 30X
6. 72℃, 5:00
7. 4℃, Infinite Hold

Agarose gel electrophoresis

Step1：制胶（1.8%）：称取1.8g agarose H，使用100ml 1x TAE溶解

• 可以先加入一些液体，在加入agarose H之后，用剩下的液体冲掉锥形瓶壁上残留的固体

Step2：在锥形瓶口蒙上一块称量纸。使用微波炉，将溶液加热沸腾至少三次

• 直到固体完全溶解
• 不要沸腾太多次

Step3：等待溶液自然冷却至50-60℃

• 此时用手背感觉微烫

Step4：在溶液当中加入8-10μl核酸染料，晃匀

• 摇晃幅度可以偏大，速度应该偏慢。避免出现气泡

Step5：将制胶板提前调平，按照样本数目选择梳齿孔数。将溶液倒入其中

• 15孔：load~20μl体系
• 20孔：load~10μl体系

Step6：等待约20min，使胶凝固

• 等待胶凝固之后，拿起梳齿的时候，轻轻慢慢地垂直拿起来，不要前后或左右摇晃，避免使胶产生裂缝

Step7：上样：拿一个透明手套，根据样本数滴加 loading dye。

• 一个样本3μl loading dye
• 加入3μl的DNA marker
• 对于已经含有loading dye的Master mix，可以忽略这一步

Step8：在140V条件下开始跑胶，大概跑到2/3的时候停止

• 注：对于1.5%的琼脂胶，40min大概可以跑到2/3。对于1.8%，40min大概能够跑到1/2